厭氧微生物的分離與培養(yǎng)淺談

一、實驗目的 

掌握Hungate厭氧操作技能，掌握厭氧微生物的培養(yǎng)基配制和厭氧菌的富集、分離和純化方法。 

二、知識背景 

產(chǎn)甲烷菌（Mathanogens）是一類以產(chǎn)生大量甲烷氣體作為能量代謝的終產(chǎn)物的特殊原核微生物，廣泛存在于各種極端厭氧環(huán)境中。作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物處理的**后一個成員，該菌與其它菌群協(xié)同作用，將大量的有機物轉化成可再生能源，對自然界中的物質(zhì)循環(huán)及當今社會能源危機中的能源替代問題具有極大的推動作用。 

產(chǎn)甲烷菌是一類嚴格的厭氧細菌，**今還未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌具有超氧化物歧化酶和過氧化氫酶，產(chǎn)甲烷菌不能除去在生命代謝過程中產(chǎn)生的超氧化物、過氧化氫等氧化產(chǎn)物，這些氧化物可損害組成細胞的大分子，如F420因子，當F420處于氧化態(tài)時，即與酶蛋白分離而失活。因此，在對甲烷菌進行分離、培養(yǎng)以及操作過程中必須給予無氧的環(huán)境。 

產(chǎn)甲烷菌廣泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和動物的腸道、昆蟲的腸道、濕樹木、地熱泉水、深?；鹕娇?、水田和海洋的沉積物、沼澤等厭氧環(huán)境中都有產(chǎn)甲烷菌存在。 

三、原理 

產(chǎn)甲烷菌是一類必須生活在厭氧生境下并伴有甲烷產(chǎn)生的古生菌，其形態(tài)和生理、生化特性呈現(xiàn)明顯的多樣性。它生長的氧化還原電位約為-0.33V，一般**適生長溫度為30～40℃，**適pH為6.0～7.2。例如細胞形態(tài)有球狀、短桿狀、長桿狀、螺旋狀和絲狀等；Gram染色反應有陽性、陰性和不定性；產(chǎn)甲烷菌生長需要的營養(yǎng)與其它微生物一樣，需要碳源、氮源、無機鹽、生長因子等。生長所需碳源約有10多種，除CO2外，還有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有當產(chǎn)甲烷菌在利用H2作CO2還原劑以產(chǎn)生生物合成所需細胞物質(zhì)，才能利用CO2作電子受體以產(chǎn)生ATP和CH4。 

四、實驗藥品、器材 1、藥品 

NH4Cl、MgCl2·6H2O、K2HPO4、KH2PO4、甲酸鈉、乙酸鈉、胰化酪蛋白、酵母膏、鹽酸半胱氨酸、刃天青、Na2S·9H2O、NaHCO3、氨三乙酸、MgSO4·7H2O、MnSO4·2H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、CoSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、ZnSO4·7H2O、KAl（SO4）2·12H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2SeO3·5H2O、生物素、葉酸、鹽酸吡哆醇、二水鹽酸硫胺、核黃素、煙酸、D-泛酸鈣、維生素B12、對氨基苯甲酸、硫辛酸。 

2、儀器用具 

裝有分壓表和相應高純氣體的氮氣鋼瓶，氫氣鋼瓶，二氧化碳鋼瓶，銅柱和銅柱固定架，高壓滅菌鍋，厭氧管（15mL），厭氧瓶（50mL），異丁烯橡膠塞、光波爐、三角燒瓶（500mL、1000mL）、各種規(guī)格的定量注射器（1mL、2mL、5mL），9#針頭，酒精燈，酒精棉球，水樣取樣器、恒溫水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱，熒光顯微鏡，氣相色譜儀等。3、試劑及配制 

（1）1%Na2S溶液  精確稱取1克Na2S 9H2O置于100mL厭氧瓶中，加入99mL無氧無菌水。 

（2）10% NaHCO3溶液  精確稱取10克NaHCO3置于100mL厭氧瓶中，加入90mL無氧無菌水。 

（3）0.1%的刃天青溶液  精確稱取0.1克刃天青，用無水乙醇適量充分溶解后，用100mL容量瓶定容**100mL。 

4、材料 

厭氧消化器沉積物。 四、實驗方法 

(一)無氧N2、H2、CO2的制備 1、原理 

運用Hungate銅柱除氧系統(tǒng)獲得無氧氣體。銅柱是一個內(nèi)部裝有銅絲（單質(zhì)Cu呈亮黃色，CuO呈黑黃色）的硬質(zhì)玻璃管。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，另一端連接出氣管口。此管的大小為直徑40mm，長約400mm，兩端被加工成漏斗狀，外壁繞有加熱帶。加熱帶通電溫度升**約350℃時，向氧化狀的銅柱通入H2時，H2與CuO中的O2結合形成H2O，而CuO被還原成了Cu，銅柱內(nèi)的Cu呈現(xiàn)明亮的黃色。當來自鋼瓶含有微量O2的N2、CO2、H2通過銅柱時，Cu和氣體中的微量O2化合生成CuO，氣體中微量的氧氣被消耗掉，從出管口出來的則為無氧氣體，而銅柱則由明亮的黃色逐漸變?yōu)楹谏脽o氧氣流驅(qū)趕厭氧管或厭氧瓶中的空氣從而獲得無氧環(huán)境。反復上述過程，銅柱則可反復使用。 

2、方法 

（1）打開Hungate銅柱除氧系統(tǒng)的的通氣橡皮管的止水夾子，開啟氫氣鋼瓶并形成氣流，流出的氫氣用橡皮管引出室外，接通電熱套電源，大約20min后，銅柱溫度能達到350℃左右，銅柱內(nèi)的銅絲被氫氣還原，由黃黑色變?yōu)榧冦~錚亮色（CuO＋H2   

Cu＋H2O），當銅柱里面的水蒸氣被排出完全后，可關閉氫氣鋼瓶，壓力表指針降為零，銅柱還原結束。用止水夾子將通氣橡皮管密閉待用。 

（2）當需要使用無氧氮氣時，打開氮氣鋼瓶，氣流大小以把針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意氣流是否足夠。此時銅柱內(nèi)的銅絲處于還原態(tài)的單質(zhì)銅，當通入高純氮（99.999%）時，其中所含的極微量氧與單質(zhì)銅反應，被固定下來（形成氧化銅），同時柱內(nèi)會產(chǎn)生水蒸氣，氧化銅與氫氣反應所致，流出銅柱的則是無氧氮氣。使用完畢后，先關緊氮氣鋼瓶，使壓力表的指示針回**零位，接著用止水夾封閉所有橡皮管。無氧氫氣、二氧化碳的使用方法相同。 

注意：在進行銅柱還原通氫氣的時候必須打開窗戶，一定熄滅操作臺邊上所有明火，包括酒精燈和電爐，操作室內(nèi)不得有明火（如抽煙、使用火柴、火機等）。 #p#分頁標題#e#

(二)無氧無菌水的配制 

1、將500mL一定濃度的NaCl水溶液（防止稀釋時細胞漲破）沿玻璃棒倒入固定在鐵架臺上的1000mL三角燒瓶中（選擇合適的圓底燒瓶，水不可太滿，否則水沸騰時容易濺出），**好放入幾個防爆玻璃珠。向500mL水中加入終濃度為0.001‰的刃天青（resazurin），即加入0.5mL 的1‰刃天青母液（W/V），并加入0.25g半胱氨酸（L-Cysteine）(終濃度0.5‰)。在燒瓶外壁溶液水平面處劃一刻度后，加入適量水（因為蒸發(fā)會損失部分水分）。煮沸5～10min（視所加水總量而定），刃天青會根據(jù)水中含氧量的下降經(jīng)歷紫色-紅色-無色的顏色變化，當溶液變?yōu)闊o色后，再煮沸5min，然后通高純氮氣1-2min（趕走空氣）。 

2、分裝的過程可以不用繼續(xù)加熱，用10mL的定量注射針筒抽進氮氣流，再打出（三次以上）洗氣，然后抽取9mL無氧水注入已換氣的15mL厭氧管中（抽取注射過程中應迅速利落，與空氣接觸時間應縮****短）；注入?yún)捬豕芎螅枰却?s～10s，以置換瓶中空氣，在抽出氮氣流針頭的同時塞緊異丁烯橡膠塞（操作要*：抽出針頭時要注意，橡膠塞應該先半扣到瓶口，然后用右手食指撳住，左手捏住通氣針頭慢慢抽出針頭，橡膠塞可能會外翻導致漏氣等，此時將針頭往瓶內(nèi)伸使塞子恢復原樣，有時需要反復多次，視塞子大小而定，**后拔出針頭，拔出同時立即將塞子塞進管口），**后旋緊蓋子。 

3、上述無氧水經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min后則獲得無氧無菌水。 （三）厭氧菌液體培養(yǎng)基配制（以制備1000mL為例）

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