1 目的
1.1 了解厭氧微生物的生長(zhǎng)特性
1.2 觀察厭氧微生物（雙歧桿菌）的形態(tài)特征
1.3 掌握厭氧微生物的滾管分離、培養(yǎng)與計(jì)數(shù)技術(shù)
2 原理
目前培養(yǎng)厭氧微生物的簡(jiǎn)便而又有效的技術(shù)包括有：厭氧箱培養(yǎng)技術(shù)；厭氧罐培養(yǎng)技術(shù)；厭氧袋培養(yǎng)技術(shù)；亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。
這里介紹的是亨蓋特厭氧滾管技術(shù)。
亨蓋特厭氧滾管技術(shù)是美G微生物學(xué)家亨蓋特（Hungate）于1950年**提出并應(yīng)用于瘤胃厭氧微生物研究的一種厭氧培養(yǎng)技術(shù)。
以后這項(xiàng)技術(shù)又經(jīng)歷了幾十年的不斷改進(jìn)，從而使亨蓋特厭氧技術(shù)日趣完善，并逐漸發(fā)展成為研究厭氧微生物的一整套完整技術(shù)。
而且多年來的實(shí)踐已經(jīng)證明它是研究嚴(yán)格、專性厭氧菌的一種極為有效的技術(shù)。
亨蓋特厭樣滾管培養(yǎng)技術(shù)不僅可用于有益厭氧菌如雙歧桿菌等的分離、與活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，還可以用于有害腐敗菌（如酪酸菌）或病
原菌（如肉毒梭狀芽孢桿菌）的分離與鑒定。
3 材料
3.1 樣品
雙歧酸奶（液體）、雙歧桿菌制劑（固體）。
3.2 培養(yǎng)基
改良MRS培養(yǎng)基，PTYG培養(yǎng)基。
3.3 儀器和器具
亨蓋特厭氧滾管裝置一套，厭氧管，厭氧瓶，滾管機(jī)，定量加樣器。
4 流程
銅柱除氧→預(yù)還原培養(yǎng)基→稀釋用液制備→稀釋樣品→滾管→培養(yǎng)→計(jì)數(shù)
5 方法
5.1銅柱系統(tǒng)除氧銅柱是一個(gè)內(nèi)部裝有銅絲或銅屑的硬質(zhì)玻璃管。此管的大小為40—400mm，兩段被加工成漏斗裝，外壁繞有加熱帶，并與變壓器
相連來控制電壓和穩(wěn)定銅柱的溫度。銅柱兩端連接膠管，一端連接氣鋼瓶，一端連接出氣管口。由于從氣鋼瓶出來的氣體如N2、C
O2和H2等通常都含有O2，故當(dāng)這些氣體通過溫度約360℃的銅柱時(shí)，銅和氣體中的微量O2化合生成CuO，銅柱則由明亮的黃
色變?yōu)楹谏?。?dāng)向氧化狀的銅柱通入H2時(shí)，H2與CuO中的氧就結(jié)合形成H2O，而CuO又被還原成了銅，銅柱則又呈現(xiàn)明亮的
黃色。此銅柱可以反復(fù)使用，并不斷起到除氧的目的。當(dāng)然H2源也可以由氫氣發(fā)生器產(chǎn)生。
5.2 預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液的制備
制作預(yù)還原培養(yǎng)基及稀釋液時(shí)，先將配制好的培養(yǎng)基和稀釋液煮沸驅(qū)氧，而后用半定量加樣器趁熱分裝到螺口厭氧試管中，一般瓊
脂培養(yǎng)基裝4.5-5ml，稀釋液裝9ml，并插入通N2氣的長(zhǎng)針頭以排除O2。此時(shí)可以清楚地看到培養(yǎng)基內(nèi)加入的氧化還原指示劑—
刃天青由藍(lán)到紅**后變成無色，說明試管內(nèi)已成為無氧狀態(tài)，然后蓋上螺口的丁烯膠塞及螺蓋，滅菌備用。
5.3 雙歧桿菌樣品不同稀釋度的制備
在無菌條件下準(zhǔn)確稱取1g固體或用無菌注射器吸取1ml混合均勻的液體樣品，而后加入裝有預(yù)還原生理鹽水的厭氧試管中，用震
蕩器將其震蕩均勻，制成10-1稀釋液。用無菌注射器吸取1ml 10-1稀釋液**另一支裝有9ml生理鹽水的試管中，制成10-2稀釋
液。按此操作方法依次進(jìn)行10倍系列稀釋**10-7，制成不同濃度的樣品稀釋液。通常選10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度進(jìn)行滾管培
養(yǎng)計(jì)數(shù)。
5.4厭氧滾管培養(yǎng)法
將盛有融化的無菌無氧瓊脂培養(yǎng)基試管放置于50℃左右的恒溫水浴中，用1ml無菌注射器分別吸取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋度
的稀釋液各0.1ml于融化了的瓊脂培養(yǎng)基試管中，而后將其平放于盛有冰塊的盤中或特制的滾管機(jī)上迅速滾動(dòng)，這樣帶菌的融化培
養(yǎng)基在試管內(nèi)壁立即凝固成一薄層。每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，而后置于37℃（酸奶樣品42℃）恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般培養(yǎng)24—4
8小時(shí)后，即可在厭氧管的瓊脂層內(nèi)或表面長(zhǎng)出肉眼可見的菌落。
5.5 雙歧桿菌活菌（分離）計(jì)數(shù)
選擇分散均勻，數(shù)量在幾十~幾百個(gè)菌落的厭氧試管進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，即可得出每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量。
5.6 計(jì)算
雙歧桿菌的活菌數(shù)量cfu/g(ml)樣品=0.1ml滾管計(jì)數(shù)的實(shí)際平均值×10×稀釋倍數(shù)
6 結(jié)果
6.1 觀察雙歧桿菌形態(tài)，描述其形態(tài)特征。
6.2 計(jì)算每克或每毫升樣品中含有的雙歧桿菌數(shù)量，記錄結(jié)果。 7 思考
1 比較平板活菌計(jì)數(shù)和滾管活菌計(jì)數(shù)的異同？
2 實(shí)驗(yàn)中通過哪些措施和方法保持細(xì)菌的厭氧狀態(tài)？
培養(yǎng)基：改良的PRAS培養(yǎng)基(氮素自加）
[配方組成——NH4CL 1g,MgCl2 0.1g,K2HPO4 0.4g,KH2PO4 0.2g,甲酸鈉5g,乙酸鈉5g,甲醇3.5ml,Ph值為7.0,蒸餾水1000ml,1%的樹脂刃天青（還原指示劑）1ml,121攝氏度滅菌20min.使用前每5ml培養(yǎng)基加入1%Na2S（還原劑）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制劑）各0.1ml]
3．1．3 試劑：冰塊 Na2S NaHCO3
